Sintesis Kemoenzimatik Terpadu dari Blok Bangunan Vaksin mRNA N1-Methylpseudouridin Trifosfat

Abstrak
Pseudouridin-5′-trifosfat (ΨTP) dan turunan N1-metilasi (m1ΨTP) merupakan blok penyusun monomer penting dari vaksin mRNA yang saat ini digunakan, namun metode sintesis yang efisien dari substrat yang mudah diakses masih belum dikembangkan. Di sini kami melaporkan rute biokatalitik yang sangat ekonomis dan berproduksi tinggi menuju ΨTP (hasil 83%) dan menyajikan dua rute kemo-enzimatik untuk memproduksi m1ΨTP pada skala ~200 mg senyawa yang diisolasi. Penataan ulang kaskade biokatalitik uridina menghasilkan ΨMP (~320 mg/mL) atau Ψ (~240 mg/mL) dengan hasil masing-masing 95%. ΨMP yang dilindungi asetonida dimetilasi N1 secara selektif menggunakan dimetil sulfat (4 ekuivalen, hasil 85%) dan selanjutnya diubah menjadi trifosfat (7,3 mg/mL; hasil 83%) melalui reaksi kaskade kinase. Saccharomyces cerevisiae uridine 5′-monophosphate kinase terbukti berperan dalam fosforilasi (m1)ΨMP menjadi (m1)ΨDP yang bergantung pada ATP. Konversi menjadi (m1)ΨTP dikatalisis oleh Escherichia coli acetate kinase. Dibandingkan dengan rute kimia yang mengubah Ψ yang diproduksi secara enzimatik menjadi m1ΨTP (hasil 37%), rute kemo-enzimatik baru dari ΨMP menawarkan metrik efisiensi reaksi yang jauh lebih baik (hasil isolasi 68%) dan keberlanjutan (limbah sekitar 3 kali lipat lebih sedikit). ΨTP dan m1ΨTP sintetis menggantikan UTP untuk sintesis mRNA melalui transkripsi in vitro. Secara keseluruhan, penelitian ini menunjukkan integrasi produktif metilasi kimia dengan reaksi kaskade enzimatik untuk penggabungan CC dan fosforilasi menuju persiapan m1ΨTP yang efisien.